Métodos de diagnóstico molecular en la práctica odontológica / Molecular diagnostic methods in dental practice

El diagnóstico molecular, mediante la aplicación de técnicas molecu- lares, ha permitido estudiar microorganismos presentes en el inicio y progresión de la caries dental, enfermedad periodontal, y en los fracasos endodónticos. Las técnicas moleculares permiten la detección y cuan- tificación del material genético del ácido desoxirribonucleico (DNA), ácido ribonucleico (RNA) o proteínas, lo que posibilita el estudio del genoma completo o secuencias de DNA específicas. Estas técnicas surgen como una necesidad de detectar microorganismos de difícil o lento crecimiento en cultivos; la técnica más utilizada es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que permite la amplificación de peque- ños segmentos de material genético al utilizar cebadores, por lo que es un método económico, preciso, sensible y rápido para la detección de microorganismos. El presente artículo de revisión bibliográfica servirá para informar sobre los avances de las técnicas moleculares utilizadas para el diagnóstico en la práctica odontológica (AU)

Molecular diagnosis, through the application of molecular techniques, has made it possible to study microorganisms present in the onset and progression of dental caries, periodontal disease, and endodontic failures. Molecular techniques allow the detection and quantification of the genetic material of deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA) or proteins, allowing the study of the complete genome or specific DNA sequences, they arise as a need to detect difficult or slow growing microorganisms in cultures. The most widely used technique is the polymerase chain reaction (PCR) that allows the amplification of small segments of genetic material using primers, it is an economical, precise, sensitive and fast method for the detection of microorganisms. This bibliographic review article will serve to report on the advances in molecular techniques used for diagnosis in dental practice (AU)

Prevalencia de Porphyromonas gingivalis en un grupo de pacientes con aparatología fija de ortodoncia / Prevalence of Porphyromonas gingivalis in a group of patients with fixed orthodontic appliances

Introducción: existen diversos patógenos que pueden afectar no sólo la salud periodontal, sino también la salud general de los pacientes. Objetivo: determinar la Porphyromonas gingivalis (PG) en el primer molar superior derecho de adolescentes, de entre 12 y 18 años, con al menos un mes de tratamiento de ortodoncia con aparatología fija. Material y métodos: se realizó un estudio observacional, descriptivo, transversal de casos en un grupo de 26 adolescentes con tratamiento de ortodoncia, compuesto de brackets metálicos, tubos o bandas, arcos NiTi termoactivos, módulos, cadenas o ligaduras; sin importar sexo, edad, tiempo de tratamiento o maloclusión. Se formaron dos pares de grupos 1 y 2 (15 mujeres y 11 hombres), A y B (13 mujeres y 13 hom- bres) comparando los resultados obtenidos entre los grupos. Resulta- dos: dentro del grupo 1 y 2 la detección molecular de microorganismos arroja que 80% fueron positivas a la PG, 58.33% presenta maloclusión y en promedio 89% de las pacientes son positivas a PG. La detección molecular del grupo A y B indica que 54.54% fueron positivos a PG, mientras que 83.3% presenta maloclusión y en promedio 47% son positivos a PG. Conclusión: la explicación de los eventos moleculares que se desencadenan en la cavidad oral y los sistemas afectados por PG contribuyen a la prevención de complicaciones al tener una mejor comprensión de los fenómenos infecciosos (AU)

Introduction: there are various pathogens that can affect not only periodontal health, but also the general health of patients. Objective: to determine Porphyromonas gingivalis (PG) in the upper right first molar of adolescents, between 12 and 18 years old, with at least one month of orthodontic treatment with fixed appliances. Material and methods: a cross-sectional descriptive observational study of cases was carried out in a group of 26 adolescents with orthodontic treatment, consisting of metal brackets, tubes or bands, thermoactive NiTi archwires, modules, chains or ligatures; regardless of sex, age, treatment time or malocclusion. Two pairs of groups 1 and 2 (15 women and 11 men), A and B (13 women and 13 men) were formed, comparing the results obtained between the groups. Results: within group 1 and 2, the molecular detection of microorganisms shows that 80% were positive for PG, 58.33% presented malocclusion and an average of 89% of patients were positive for PG. The molecular detection of group A and B indicates that 54.54% were positive for PG while 83.3% presented malocclusion and on average 47% were positive for PG. Conclusion: the explanation of the molecular events that are triggered in the oral cavity and the systems affected by PG contribute to the prevention of complications by having a better understanding of the infectious phenomena (AU)

Molecular detection of visceral leishmaniasis in dogs from Barão de Melgaço, Pantanal region of Mato Grosso, Brazil / Detecção molecular de leishmaniose visceral em cães do município de Barão de Melgaço, Pantanal Mato-Grossense, Brasil

The increasing expansion of visceral leishmaniasis (VL) in the Brazilian territory evidences the need for studies focused on the main reservoir of this parasite: the dog. This study aimed to conduct an epidemiological survey in the municipality of Barão de Melgaço, Pantanal region of the state of Mato Grosso (MT), Brazil. Conventional polymerase chain reaction (PCR) and qualitative SYBR®Green real-time PCR (qPCR) were used to diagnose canine VL (CVL) and characterize the factors associated with this infection. Of the 402 dogs that had blood samples collected, 31 presented the parasite DNA, representing a prevalence of 7.71% in the population studied. Positivity indices for PCR and qPCR were 3.48 (14/402) and 7.21% (29/402), respectively. Comparison of the results obtained by both techniques showed moderate agreement (Kappa = 0.5364). Of the independent variables analyzed, presence of clinical signs (p≤0.05) was the only one associated with CVL. Based on this study, we conclude that VL is a circulating disease, with relatively low prevalence, in dogs of Barão de Melgaço/MT, and that the presence of clinical signs is the only variable associated with canine infection.(AU)

A crescente expansão da leishmaniose visceral (LV) no território brasileiro evidencia a necessidade de estudos voltados ao principal reservatório doméstico do parasito: o cão. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi realizar um inquérito epidemiológico no município de Barão de Melgaço, região do Pantanal Mato-grossense, utilizando as técnicas de reação em cadeia pela polimerase convencional (PCR) e teste qualitativo SYBR®Green real-time PCR (qPCR) para o diagnóstico da LV canina (LVC), além de caracterizar os fatores associados a infecção. Do total de 402 cães que tiveram amostras sanguíneas coletadas, 31 apresentaram o DNA do parasito, perfazendo uma prevalência de 7,71% na população estudada. Os índices de positividade para a PCR e qPCR foram de 3,48% (14/402) e 7,21% (29/402), respectivamente. A comparação dos resultados obtidos por ambas técnicas apresentou moderada concordância (Kappa = 0,5364). Das variáveis independentes analisadas, a presença de sinais clínicos (p≤0,05) foi a única associada a ocorrência de LVC. Com base neste estudo, concluímos que a LV está circulando, com prevalência relativamente baixa, em cães de Barão de Melgaço/MT, sendo a presença de sinais clínicos a única variável associada à infecção canina.(AU)

Utilidad de las técnicas de biología molecular en neuroinfecciones / Usefulness of molecular biology techniques in neuroinfectious diseases / Utilidade das técnicas de biologia molecular em neuroinfecções

Resumen: Introducción: un porcentaje de las infecciones del sistema nervioso central permanece sin diagnóstico etiológico. Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real pueden disminuir este porcentaje. Objetivo: describir la etiología de las neuroinfecciones y valorar la utilidad de las técnicas de biología molecular en el diagnóstico y su impacto en el tratamiento antimicrobiano. Metodología: estudio observacional, descriptivo, retrospectivo a partir de registros clínicos. Se incluyeron mayores de 18 años asistidos en un hospital público de Montevideo durante un período de 32 meses, a quienes que se les realizaron técnicas de biología molecular en líquido cefalorraquídeo por sospecha clínica de neuroinfección. Resultados: se incluyeron 109 pacientes. En pacientes sin infección por VIH ni antecedentes neuroquirúrgicos (67%), se identificó microorganismo responsable en 16 casos, 8 bacterias y 9 virus. Todos identificados por técnicas de biología molecular modificando el tratamiento antimicrobiano empírico en 25 casos (34,2%). En portadores de VIH (25,7%), se detectaron microorganismos en 14 pacientes (50%). Seis virus, 5 bacterias y 7 hongos (Cryptococcus neoformans). El estudio por técnicas de biología molecular determinó el diagnóstico de 17 microorganismos y modificó el plan antimicrobiano inicial en 12 casos (42,9%). En pacientes con antecedente de neurocirugía reciente (7,3%), se aislaron seis microorganismos, tres de ellos exclusivamente mediante cultivo. Se modificó el tratamiento en tres casos (37,5%). Conclusiones: las técnicas de biología molecular deben considerarse complementarias. El impacto que generan en el diagnóstico y tratamiento justifica el uso de estas técnicas a pesar de su mayor costo.

Summary: Introduction: a certain percentage of infections of the central nervous system have no etiological diagnosis. Nucleic acids amplification techniques by means of a polymerase chain reaction in real time may reduce this percentage. Objective: to describe etiology of neuroinfectious diseases and assess the usefulness of molecular biology techniques in their diagnosis, as well as its impact on antimicrobial treatment. Method: observational, descriptive, retrospective study based on clinical records which included patients older than 18 years old, who had been assisted in a public hospital in Montevideo for over 32 months and had undergone molecular biology techniques with cerebrospinal fluid (CSF) given the clinical suspicion of neuroinfection. Results: 109 patients were included in the study. Among non-HIV infected patients who had not undergone neurosurgeries the responsible microorganism was identified in 16 cases (8 bacteria and 9 virus). They were all identified by molecular biology techniques by modifying the empiric antimicrobial therapy in 25 cases (34.2%). In carriers of HIV (25.7%), microorganisms were identified in 14 patients (50%). Six virus, 5 bacteria and 7 fungi (Cryptococcus neoformans). Molecular biology techniques defined the diagnosis of 17 microorganisms and modified the initial antimicrobial plan in 12 cases (42.9%). In patients with a history of recent neurosurgery (7.3%), 6 microorganisms were isolated, 3 of them exclusively through cultures. Treatment was modified in 3 cases (37.5%). Conclusions: molecular biology techniques need to be regarded as a complement. The impact that have in diagnosis and therapy justify their use despite its higher cost.

Resumo: Introdução: uma proporção das infecções do sistema nervoso central permanece sem diagnóstico etiológico. As técnicas de ampliação de ácidos nucléicos por reação em cadeia da polimerase em tempo real, podem diminuir esta proporção. Objetivo: descrever a etiologia das neuro infecções e avaliar a utilidade das técnicas de biologia molecular no diagnóstico e seu impacto no tratamento antimicrobiano. Metodologia: estudo observacional, descritivo, retrospectivo de prontuários de pacientes. Foram incluídos pacientes maiores de 18 anos, atendidos em um hospital público de Montevidéu, durante um período de 32 meses. Foram realizadas técnicas de biologia molecular ao líquido cefalorraquidiano por suspeita clínica de neuroinfecção. Resultados: foram incluídos 109 pacientes. Em pacientes sem infecção por VIH e sem antecedentes neurocirúrgicos (67%), o microrganismo responsável em 16 casos, sendo 8 bactérias e 9 vírus. Todos foram identificados por técnicas de biologia molecular modificando el tratamento antimicrobiano empírico em 25 casos (34,2%). Em portadores de VIH (25,7%), foram detectados microrganismos em 14 pacientes (50%). Seis vírus, 5 bactérias e 7 leveduras (Cryptococcus neoformans). O estudo por técnicas de biologia molecular permitiu o diagnóstico de 17 microrganismos e modificou o tratamento antimicrobiano inicial em 12 casos (42,9%). Em pacientes com antecedentes de neurocirurgia recente (7,3%), foram isolados 6 microrganismos, em 3 casos exclusivamente por cultura. O tratamento foi modificado em 3 casos (37,5%). Conclusões: as técnicas de biologia molecular devem ser consideradas como complementares. O impacto que causam sobre o diagnóstico e o tratamento justifica seu uso apesar de seu maior custo.

La biología molecular en el diagnóstico de la leucemia mieloide aguda / Molecular biology in the diagnostic of acute myeloid leukemia

Introducción: La biología molecular ha permitido identificar los genes de fusión que se forman a consecuencia de reordenamientos cromosómicos aberrantes e identificar alteraciones moleculares no observables mediante la citogenética. En algunos casos, la presencia de alteraciones cromosómicas o moleculares correlaciona con determinados subtipos de leucemia mieloide aguda (LMA) definidos por sus características citomorfológicas. Sin embargo, en otros no sucede así, por lo que el conocimiento de ciertas alteraciones moleculares ha hecho posible la definición de nuevos subtipos de LMA. Objetivo: Esta revisión pretende destacar cómo la biología molecular ha cobrado importancia en el diagnóstico y pronóstico de las LMA. Desarrollo: Primero refiere las alteraciones moleculares más frecuentes que se forman debido a aberraciones cromosómicas. A continuación, se describen las mutaciones génicas que con mayor frecuencia aparecen en la LMA. Un tercer apartado, destaca las alteraciones de mayor impacto para el pronóstico. Finalmente, se describe cómo la clasificación de las LMA ha cambiado debido al descubrimiento progresivo de alteraciones moleculares que correlacionan con comportamientos particulares en cuanto a evolución y respuesta al tratamiento(AU)

Introduction: Molecular biology has allowed the identification of fusion genes formed as a consequence of aberrant chromosome rearrangement and to find molecular alteration not observed by cytogenetic. In occasion, the presence of some chromosomal or molecular alterations correlate with specific subtypes of acute myeloid leukemia (AML) previous defined by its cytomorphological features. However, in others cases there is not total correspondence with and the knowledge of molecular anomalies has been possible to define new subtypes of AML. Objective: To highlight how the molecular biology has been gain relevance for the diagnostic and prognostic of the AML. Development: First, are mentioned the more frequent molecular alterations formed a cause of chromosomal aberrations. After, are described the more frequent gene mutations appeared in AML cases. A third topic, point out the alterations of mayor impact for the prognostic. Finally, is described how has change the classification of AML because the progressive discovery of new molecular alterations that match with particular evolution and treatment response(AU)

Biologia Molecular como ferramenta de detecção fúngica no sangue: auxílio diagnóstico e redução de gastos / Molecular Biology as a tool for fungal detection on blood: diagnostic aid and cost reduction

Introdução: Os avanços médicos das últimas décadas contribuíram para aumentar a sobrevida de pacientes críticos e com a resposta imune comprometida. Consequentemente, a população em risco de adquirir infecções de origem fúngica também cresceu. Com altas taxas de morbidade e mortalidade, o difícil diagnóstico deste tipo de infecção, em conjunto com terapias ineficazes, gera elevados custos e sobrecarga ao sistema de saúde. Objetivos: Padronizar um método molecular de detecção fúngica diretamente do sangue e avaliar esta técnica comparativamente com a atualmente considerada padrão-ouro (hemocultura), associando aspectos clínicos, tempo de realização das técnicas e os custos envolvidos. Casuística e Métodos:Neste sentido, 94 pacientes com suspeita de infecção de corrente sanguínea foram submetidos a uma técnica de nestedPCR para detecção de DNA fúngico. Resultados: A técnica molecular foi positiva em 48,9% das amostras, enquanto que a hemocultura foi positiva em apenas 13,0% dos casos. Esses resultados demonstram uma alta sensibilidade do nested PCR e com um valor preditivo negativo de 100% em pacientes com suspeita clínica de infecção fúngica sistêmica e em situações de risco. O tempo de realização do método e os custos associados a ele, em comparação à hemocultura, também demonstraram seu potencial para uso clínico. Conclusões: Em comparação com a hemocultura, o método padronizado de nestedPCR constitui um teste rápido e economicamente viável capaz de descartar uma infecção sistêmica provocada por fungo, podendo facilitar o diagnóstico e evitar terapias ineficientes e caras, diminuir o tempo de internação e os impactos econômicos gerados por esse tipo de infecção.

Introduction: Medical advances in the past decades have contributed to the increase of survival of critically ill patients and the ones with impaired immune response. Consequently, the population at risk of acquiring a fungal infection also has increased. This type of infection generates expensive costs and heavy burden to the Health system. It also brings high morbidity and mortality rates, difficulty in diagnosing, and ineffective therapies. Objectives: Standardize a molecular method of fungal detection directly from blood and compare this technique with the blood culture, which is currently considered the gold standard. It associates clinical aspects, time, and costs involved. Patients and Methods: In this sense, 94 patients with suspected bloodstream infection were submitted to the technique of nested PCR for detection of fungal DNA. Results: The molecular technique was positive in 48.9% of the samples, while the blood culture was positive in only 13% of the cases. These results demonstrate high sensibility of the nested PCR and negative predictive value of 100%. The performing time and the costs associated with the method also demonstrated its value for clinical use. Conclusions: Therefore, the nested PCR is a quick and economically viable test, capable of ruling out a systemic infection caused by fungus, being able to facilitate the diagnosis, avoid inefficient and expensive therapies, and decrease the length of hospital stay, reducing the burden caused by this type of infection.

Novos reguladores de resposta envolvidos na virulência de Pseudomonas aeruginosa / New response regulators involved in Pseudomonas aeruginosa virulence

Os sistemas de sinalização de dois componentes são sistemas prevalentes em bactérias, permitindo a adaptação a diferentes condições ambientais. O sistema de dois componentes classicamente possui uma proteína histidina quinase, o primeiro componente, capaz de reconhecer o estímulo ambiental e fosforilar o regulador de resposta, o segundo componente. Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria ubíqua, capaz de infectar hospedeiros filogeneticamente distintos. Esse patógeno oportunista apresenta um dos maiores conjuntos de sistemas de dois componentes em bactérias, que permite que ela sobreviva numa grande gama de ambientes, incluindo humanos. P. aeruginosa UCBPP-PA14 apresenta pelo menos 64 histidina quinases e 76 reguladores de resposta codificados em seu genoma. Diversos sistemas de dois componentes já foram correlacionados com a virulência, sendo o sistema GacSA o exemplo melhor caracterizado. Há poucos estudos sistemáticos sobre o envolvimendo dos reguladores de resposta na virulência de P. aeruginosa e os sinais que induzem a ativação dos reguladores de resposta precisam ser encontrados. Para identificar novos reguladores de resposta envolvidos na patogenicidade, infecções in vitro em macrófagos e in vivo em Drosophila melanogaster foram realizadas neste trabalho. Os macrófagos foram infectados com cada mutante dos reguladores de resposta ou com a linhagem selvagem, e a produção da citocina pró-inflamatória TNF-α e o clearance bacteriano foram determinados. Alternativamente, as moscas foram infectadas utilizando-se a estratégia de feeding e a sobrevivência foi verificada. Utilizando-se essas abordagens, a identificação de diversos reguladores de resposta com papel na virulência foi alcançada, além de se corfirmar o papel de reguladores de resposta já estudados. Um dos novos genes envolvidos em virulência, PA14_26570 (nomeado neste trabalho de atvR), codifica um regulador de resposta atípico com substituição no aspartato fosforilável para glutamato, o que usualmente induz um estado sempre ativo. Um mutante não polar em atvR foi construído e macrófagos infectados com a linhagem ΔatvR confirmaram um maior clearance bacteriano e maior produção de TNF-α em comparação aos macrófagos infectados com a linhagem selvagem. Para comprovar a participação de AtvR durante a patogênese, um modelo de pneumonia aguda em camundongos foi utilizado. Camundongos infectados com a linhagem ΔatvR apresentaram uma maior sobrevivência em comparação aos camundongos infectados com a linhagem selvagem. Além disso, os camundongos infectados com ΔatvR apresentaram menor carga bacteriana, aumento no recrutamento de neutrófilos ativados e aumento na produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IFN-γ). Utilizando-se uma abordagem transcritômica (RNA-Seq), foi determindo diversos genes são regulados positivamente na linhagem superexpressando AtvR em relação à linhagem controle. Dentre esses, os clusters de respiração anaeróbia nar, nir, nor e nos estão incluídos. Esse resultado foi confirmado por qRT-PCR e análises fenotípicas, em que a linhagem ΔatvR apresentou menor crescimento e expressão da nitrato redutase durante condições de hipóxia em comparação à linhagem selvagem. Em suma, neste trabalho foi demonstrado que diversos reguladores de resposta são importantes para a virulência de P. aeruginosa em macrófagos in vitro e in vivo em Drosophila, além de caracterizar o regulador de resposta atípico AtvR, que regula a respiração anaeróbica por desnitrificação, permitindo que P. aeruginosa possa infectar e colonizar o hospedeiro com maior eficiência

Two-component systems are widespread in bacteria, allowing the adaptation to environmental changes. A two-component system is classically composed by a sensor kinase that phosphorylates a cognate response regulator. Pseudomonas aeruginosa is a ubiquitous proteobacterium able to cause disease in several hosts. This opportunistic pathogen presents one of the largest sets of two-component systems known in bacteria, which certainly contributes to its ability to thrive in a wide range of environmental settings, including humans. P. aeruginosa UCBPP-PA14 genome codes for at least 64 sensor kinases and 76 response regulators. Some response regulators are already known to be related to virulence, with the GacSA system as the best characterized. There are no systematic studies about the involvement of P. aeruginosa response regulators in virulence. Moreover, the input signal that triggers the response regulator activation is yet to be uncovered for most systems. To find new response regulators involved in virulence, in vitro infections werecarried out using macrophages. Briefly, the macrophages were infected with each response regulator mutant or the wild-type strain, the pro-inflammatory cytokine production (TNF-α) and the bacterial clearance were evaluated. Using this approach, we identified several response regulators involved in virulence, and we also confirmed the involvement of known response regulators in this process. One of the novel virulence-related response regulators, PA14_26570 (named here as AtvR), is an atypical response regulator with a substitution in the phosphorylable aspartate to glutamate, that usually leads to an always-on state. A non-polar mutant was constructed, and macrophage infection with ΔatvR confirmed an increased bacterial clearance as well as a higher TNF-α production as compared to the wild-type strain. To ascertain the role of AtvR during the pathogenic process, an acute pneumonia model was used. Mice infected with ΔatvR showed an increased survival as compared to mice infected with the wildtype strain. In addition, ΔatvR infected mice showed reduced bacterial burden, increased neutrophil recruitment and activation, as well as increased pro-inflammatory cytokine production (TNF-α and IFN-γ). Also, using a transcriptomic approach (RNASeq), we showed that several genes were upregulated in the strain overexpressing AtvR. These genes include the anaerobic respiration clusters nar, nir, nor and nos. This result was confirmed by qRT-PCR and phenotypic analysis, in which ΔatvR showed reduced growth and nitrate reductase expression during hypoxic conditions as compared to the wild-type strain. In conclusion, we have demonstrated that several response regulators are important for P. aeruginosa virulence in vitro. In addition, we further characterized the atypical response regulator AtvR, which regulates anaerobic respiration via denitrification, allowing this bacterium to infect and colonize the host more efficiently

Técnicas de Biología Molecular en el desarrollo de la investigación. Revisión de la literatura / Molecular Biology Techniques for research development. A literature review

troducción: Epidemiología etimológicamente significa ciencia que estudia enfermedades que afecta a las comunidades; esta ha venido evolucionando a través de los siglos describiendo y explicando la dinámica de la salud poblacional; ha integrado nuevas ramas, como la epidemiología molecular definida como una disciplina en la cual se implementa técnicas moleculares para aportes científicos, de investigación y clínico. Objetivo: Presentar las técnicas con fundamento en biología molecular, que han aportado al desarrollo de la investigación. Material y Métodos: Se realizó revisión de artículos científicos durante los meses de agosto a octubre de 2016 y julio a septiembre de 2017, en inglés, portugués, francés y español en revistas científicas Pubmed, Scielo, Biomed Central, Free Medical Journals, LILACS, Redalyc, Inbiomed, Dialnet, usando términos DeCs descriptores de Ciencias de la Salud y MeSH; se emplearon artículos publicados en el período de 2012 a 2017, usando publicaciones de años anteriores como aporte a la historia del tema. Resultados: se presentan 05 técnicas de Biología molecular que han aportado a la investigación: RCP, Secuenciación, Hibridación de sondas de ADN, RAPD y RFLP. Conclusiones: Hoy en día el uso técnicas moleculares permite el estudio de genoma completo o secuencias específicas de ADN cortas o largas con el fin de detectar y analizar secuencias de interés para la investigación en las ciencias agronómicas, forenses, diagnóstico clínico e investigación básica, traslacional y aplicada; cada una de ellas se caracteriza por la confiabilidad y rapidez en la obtención del resultado, robustez, especificidad, sensibilidad y flexibilidad, comparado con métodos fenotípicos(AU)

Introduction: Epidemiology, from the etymological point of view, means science that studies the diseases that affect the communities. It has been developing through centuries, describing and explaining the dynamics of population health; it has integrated new branches such as molecular epidemiology defined as a discipline in which molecular techniques are implemented for clinical, research, and scientific contributions. Objective: To present techniques with basis in molecular biology, which have contributed to research development. Material and methods: A review of scientific articles was made during the months of August-October of 2016, and July-September, 2017 in English, Portuguese, French, and Spanish languages, in scientific journals such as Pubmed, Scielo, Biomed Central, Free Medical Journals, LILACS, Redalyc, Inbiomed, and Dialnet, using DeCs term descriptors of Health Sciences, and the MeSH descriptor; articles published during the time period from 2012-2017 were used, and publications of previous years were also taken into consideration as a contribution to the history of this topic. Results: 05 techniques of molecular biology which have contributed to research development were presented: PCR, sequencing, hybridization with DNA probes, RAPD, and RFLP. Conclusions: At present, the use of molecular techniques allows the complete genome or short and long sequences of DNA with the aim of detecting and analyzing sequences of interest for research in agronomy and forensic sciences, clinical diagnosis and basic, translational, and applied research, each of them characterized by reliability and quickness in obtaining result, strength, specificity, sensitivity, and flexibility, compared to phenotypic methods(AU)

Cinco décadas de la biología molecular y la citogenética aplicadas a la hematología cubana / Five decades of molecular biology and cytogenetic applied to cuban hematology

La biología molecular (BM) es una ciencia que ha revolucionado el desarrollo científico en los últimos años. En el Instituto de Hematología e Inmunología (IHI) también ha evolucionado progresivamente conforme al avance tecnológico y adecuándose cada vez más al contexto científico internacional. Su historia se remonta al año 1966, con la creación del IHI y posteriormente del laboratorio de BM. En el año 2012, el departamento de BM y el laboratorio de citogenética, pasaron a formar parte de lo que hoy es el Centro de Tecnologías de Avanzada, un área con tecnología de punta que ha permitido actualizar la mayoría de las técnicas moleculares que se empleaban previamente, lo que garantiza mayor rapidez y confiabilidad de los resultados. Se introdujeron y perfeccionaron técnicas como la extracción y cuantificación de ácidos nucleicos, la electroforesis capilar y el FISH (del inglés: Fluorescence In Situ Hybridization) y se adquirieron modernas máquinas termocicladoras para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR , siglas en inglés), materiales y reactivos. Con este esfuerzo mancomunado en estos 50 años, se han podido beneficiar hasta la fecha: 5 460 pacientes, estudiados en el laboratorio de BM, donde se determinan actualmente 10 marcadores moleculares, 12 estudios de FISH; además del cariotipo convencional y los estudios de quimerismo. Se ha alcanzado una media anual de 317 pacientes estudiados, en los últimos 5 años. Se cuenta con profesionales de alta calificación, lo que ha posibilitado liderar y colaborar en proyectos de investigación nacionales e internacionales, publicar innumerables artículos científicos, obtener premios relevantes y formar a los residentes de la especialidad de Hematología. Las perspectivas comprenden la incorporación de la PCR en tiempo real y la secuenciación para completar un nivel de diagnóstico a la altura de cualquier prestigioso centro internacional y así poder ofrecer un servicio de calidad a los pacientes(AU)

Molecular biology (MB) is a science that has revolutionized scientific development in recent years. It has also increasing progressively at the Institute of Hematology and Immunology (IHI) as adapting to technological advances and international scientific context. Its history dates back to 1966, with the IHI creation and subsequently the MB laboratory. Since then they have been many achievements in the field of diagnosis and research in Hematology. In 2012, the MB department with the cytogenetic laboratory was part of the Center for Advanced Technologies; an area with modern technology that has allowed change old studies by updated molecular techniques, ensuring greater speed and reliability of results. Techniques such as extraction and quantification of nucleic acids (NA), capillary electrophoresis and the FISH (Fluorescence in Situ Hybridization) were introduced, and modern thermocyclers for polymerase chain reaction (PCR), materials and reagents were acquired too. In these 50 years, 5 460 patients have been benefited to date. We study about 10 molecular markers, 12 FISH study, in addition to conventional karyotyping and chimerism studies in the MB lab at this moment. It has gone an annual average of 317 patients in the last 5 years. We have highly qualified professionals, which has made possible to lead and collaborate on national and international research, publishing numerous scientific articles, obtain relevant prizes of science and technology forum and directly contribute to the residents' formation in Hematology. Our future perspectives include the new technologies incorporation such as real-time PCR and sequencing, to complete a similar diagnostic level to any prestigious international center so we can provide quality service to our patients(AU)

Ébolavirus: biología molecular y evasión de la respuesta inmune / Ebolavirus: molecular biology and immune response evasion

La actual epidemia de enfermedad por virus Ébola que azota al África Occidental ha cobrado la vida de alrededor de 9 000 personas con más de 22 000 infectados en seis países, y algunos casos aislados han llegado a ciudades de Europa y Estados Unidos. Aunque el curso clínico de la enfermedad es bien conocido, los mecanismos específicos que explican su patogenicidad no han sido completamente delineados. Los casos fatales de infección por Ébolavirus están marcados por un fallo catastrófico de las respuestas inmune innata y adaptativa, mediado por proteínas codificadas por el virus, así como por propiedades asociadas a su estructura. El genoma del Ébolavirus está constituido solamente por siete genes que codifican unas 10 proteínas, suficientes para desencadenar una enfermedad cuya letalidad varía del 40 al 90 por ciento. En el centro de la desregulación inducida por el Ébola se encuentra una temprana y coordinada actuación de las proteínas VP24, VP30 y VP35, que conduce a niveles elevados de replicación viral, a una inapropiada temporización de la cascada de liberación de linfocinas y a la muerte, tanto de células presentadoras de antígenos, como de células efectoras. Los complejos mecanismos del Ébola para regular selectivamente la respuesta inmune y su patogenicidad variable en diferentes especies hospederas, convierten a este virus en un adversario formidable, así como de un notable interés científico(AU)

The current Ebolavirus disease outbreak that strikes West Africa has claimed the life of around 9 000 people and has infected more than 22 000 in six countries, and some isolated cases have reached cities of Europe and the United States. Though the clinical course of the disease is well known, the specific mechanisms of its pathogenicity have not been fully delineated yet. Fatal cases of Ebolavirus disease are marked by a catastrophic failure of both innate and adaptive immune responses, mediated by virus-encoded proteins as well as properties associated with its structure. Ebolavirus genome comprises only seven genes encoding about 10 proteins, enough to cause a disease which fatality fluctuates from 40 to 90 percent. At the heart of Ebola-induced immune dysregulation is an early and coordinated disruption by VP24, VP30, and VP35 that leads to elevated levels of virus replication, a cascade of inappropriately timed cytokine release, and death of both antigen-presenting and responding immune cells. The complex mechanisms of Ebola to selectively regulate immune responses and its variable pathogenicity in different host species makes this virus both, a challenging foe and scientifically interesting(AU)

Utilidad de las herramientas moleculares para la identificación de Leptospira spp. en muestras humanas, animales y ambientales / Usefulness of molecular tools to identify Leptospira spp. in human, animal and environmental samples

Leptospirosis es una enfermedad zoonótica endémica de potencial epidémico que afecta la salud pública y la producción pecuaria alrededor del mundo. Su agente etiológico es una espiroqueta del género Leptospira, con 20 especies reportadas hasta el momento, son las más importantes Leptospira interrogans (patógena) y Leptospirabiflexa (saprófita). Esta bacteria se transmite mediante contacto directo o indirecto en especial con orinade animales infectados, es la transmisión por medio del agua una de las más importantes. En cuanto al diagnóstico se ha evidenciado que diversas pruebas moleculares tienen una alta especificidad y sensibilidad; sin embargo, el conocimiento de la epidemiología de la leptospirosis se ha basado principalmente en estudios serológicos que han utilizado la prueba de aglutinación microscópica que presenta debilidades en sus resultados e interpretación. El objetivo del presente artículo es presentar una revisión actualizada sobre la utilidad de las herramientas moleculares para la identificación de Leptospira spp. en muestras humanas, animales y ambientales. Se llevó a cabo una búsqueda de literaturaen diferentes bases de datos como Pubmed, Science Direct, SciELO, Scopus y Redalyc.Las publicaciones encontradas fueron artículos originales y de revisión, entre otros, publicados entre 1965 y 2014. Se determinó que las herramientas moleculares permiten una identificación directa, rápida, definitivay precisa del agente etiológico, apoyan el diagnóstico, aportan al conocimiento real de laprevalencia e incidencia de la enfermedad. Las herramientas moleculares permiten la identificación de nuevas especies a partir de aislamientos obtenidos de diversas fuentes y ayudan a orientar los programas de prevención y control de esta zoonosis(AU)

Leptospirosis is an endemic and potentially epidemic zoonosis affecting public health and livestock production worldwide. Its etiological agent is a spirochaete of the genus Leptospira, with 20 species reported to date, of which Leptospira interrogans (pathogenic) and Leptospira biflexa (saprophyte) are the most important. This bacterium is transmitted by direct or indirect contact with urine from infected animals, so water is one of the major transmission ways. Regarding diagnosis, many molecular tests have been evinced to have high specificity and sensitivity; however, knowledge on the epidemiology of leptospirosis has been based mainly on serological studies using the microscopic agglutination test, which has weaknesses in its results and interpretation. The aim of this article is to present an update review on the usefulness of molecular tools in the identification of Leptospira spp. in human, animal and environmental samples. A literature search was conducted in different databases such as PubMed, ScienceDirect, SciELO, Scopus and Redalyc. The publications found were original and review articles, among others, published between 1965 and 2014. It was found that the molecular tools allow direct, quick, definitive and precise identification of the etiologic agent, support the diagnosis, and contribute to real knowledge on the disease prevalence and incidence. Molecular tools enable the identification of new species isolates obtained from various sources and help guide prevention programs and control of this zoonosis(AU)

Bases moleculares del síndrome de Rett, una mirada actual / Molecular basis of Rett syndrome: A current look

El síndrome de Rett (SR) es un trastorno del neurodesarrollo que afecta casi exclusivamente a niñas y cursa secundariamente con autismo. Es poco frecuente y consta de 5 formas clínicas, una clásica y el resto atípicas que comprometen de manera general la habilidad manual, el lenguaje y la motricidad amplia unida a la aparición de estereotipias y epilepsia precoz. Con el objetivo de actualizar la información sobre SR, se aplicaron los descriptores de búsqueda Síndrome de Rett, genes y «Síndrome de Rett¼, «Rett Syndrome gene¼, «Rett Syndrome¼, «Rett Syndrome gene therapy¼ y «Rett Syndrome review¼. Se investigó en los archivos digitales PubMed, Hinari, SCIELO y Medline, y se consultaron los sitios web OMIM, ORPHANET, GeneMap, Genetests, Proteins y Gene, entre otros. Entre 1.348 artículos se seleccionaron 42, los cuales reportan 3 genes causantes del síndrome: MECP2, CDKL5 y FOXG. El gen MECP2 está mutado en el 80% de los pacientes con SR clásico así como en el 40% de los afectados con alguna de sus formas atípicas. El SR con epilepsia precoz y la variante congénita se deben fundamentalmente a variaciones en los genes CDKL5 y FOXG1 respectivamente. Conclusiones: El diagnóstico del SR se basa en criterios clínicos, sin embargo, los avances en la biología molecular y en la genética en particular han abierto el abanico de posibilidades diagnósticas a las diferentes formas clínicas que antes quedaban sin clasificar, a la vez que el análisis molecular permite confirmar el criterio clínico y aportar información en cuanto al pronóstico del paciente.

Rett syndrome (RS) is a neurodevelopmental disorder that exclusively affects girls, and occurs along with autism. It is very uncommon, and has five distinct forms, one classic and the others atypical, which generally compromise manual skills, language, and mobility, and widely associated with the appearance of stereotypy and early epilepsy. With the aim of updating the information about RS, a search was performed in the computer data bases of PubMed, Hinari, SCIELO and Medline, as well as consulting other web sites including OMIM, ORPHANET, GeneMap, Genetests, Proteins and Gene, using the descriptors "Síndrome de Rett", "genes y Síndrome de Rett", "Rett Syndrome gene", "Rett Syndrome", "Rett Syndrome gene therapy", and "Rett Syndrome review". Of the 1,348 articles found, 42 articles were selected, which reported 3 genes causing the syndrome: MECP2, CDKL5 and FOXG. The MECP2 gene is mutated in 80% of patients with classic RS, as well as in 40% of those affected by any of its atypical forms. RS with early epilepsy and the congenital variant are mainly due to variations in the CDKL5 and FOXG1 genes, respectively. Conclusions: The diagnosis of RS is based on clinical criteria. However, the advances in molecular biology and genetics have opened a wide range of possibilities for diagnosing the different clinical forms that could not be classified before. Molecular analysis can help confirm the clinical criteria and provided information as regards the prognosis of the patient.

Prospecção de LRV1 em Leishmania braziliensis do estado de Minas Gerais

Leishmania RNA vírus (LRVs) são comumente encontrados infectando espécies de Leishmania, especialmente as do subgênero Viannia. O LRV1 é um vírus RNA de cadeia dupla (Totiviridae) descrita pela primeira vez em cepas de Leishmania guyanensis e Leishmania braziliensis da região amazônica. Dados anteriores demonstraram que cepas infectados com LRV1 provoca um perfil próinflamatório mais Exacerbado parcialmente causada pela activação de receptoresToll like 3 (TLR3) através do cDNA viral. A presença de cepas infectadas pelo LRV1 já foi detectado em biópsia de pacientes com leishmaniose cutânea (LC) da cidade de Caratinga, Minas Gerais. No entanto, não há informações da frequência de LRV1 para outras regiões endêmicas do Estado. O principal objetivo deste estudo é a prospecção da presença de LRV1 em cepas de Leishmania braziliensis isoladas de regiões no estado de Minas Gerais incluindo São João das Missões, onde são relatados muitos casos de CL na reserva indígena de Xacriabá e também formas atípicas de leishmaniose cutânea causa das por L. braziliensis que nunca anteshaviam sido prospectadas para o LRV1. As reacções de PCR utilizaram iniciadores para a cápsideo viral e o cDNA de L. guyanensis (MHOM/BR /75/M4147) foi utilizado como controlo positivo. Foram prospectadas 41 cepas de L. braziliensis de várias regiões do Estado de Minas Gerais e alguns outros de outras regiões. A presença deLVR1 em parasitos isolados a partir de pacientes não foi observada. Esses resultados sugerem que a frequência de LRV1 em cepas de L. braziliensis parecem ser muito baixa na região Sudeste do Brasil.

Estudo da mutação da STAT5B em Criciúma-Santa Catarina: frequência e caracterização fenotípica de indivíduos heterozigotos / Study of STAT5B mutation in Criciúma - Santa Catarina: frequency and phenotypic characterization of heterozygous individuals

Mutações inativadoras em homozigose no gene do transdutor de sinal e ativador de transcrição 5B (STAT5B) causam insensibilidade ao hormônio de crescimento associada a disfunção imunológica grave que se manifesta na forma de infecções exacerbadas e de repetição, pneumonia intersticial linfocítica e outros eventos autoimunes. A caracterização do fenótipo destas mutações em heterozigose não foi realizada previamente. Dois pacientes descritos com mutação em homozigose na STAT5B (c.424_427del / p.L142RfsX19) são irmãos brasileiros naturais de Criciúma - Santa Catarina, sem consanguinidade conhecida na família. Houve também o relato de dois outros casos semelhantes na cidade, já falecidos, sugerindo que mutações na STAT5B pudessem ser relativamente frequentes nesta região. Os objetivos deste estudo foram investigar a frequência da mutação c.424_427del da STAT5B na população de Criciúma, avaliar a existência de efeito fundador e caracterizar o efeito da mutação c.424_427del da STAT5B em heterozigose sobre o fenótipo antropométrico e hormonal. Para investigar a frequência desta mutação em Criciúma, 1192 indivíduos da população foram genotipados. Foram identificados sete indivíduos heterozigotos, caracterizando uma frequência alélica mínima de 0,29% (intervalo de confiança 95%: 0,08 a 0,5%), significativamente mais alta que a frequência de outras variantes patogênicas da STAT5B descritas em bases de dados públicas. Utilizando-se o equilíbrio de Hardy-Weinberg, foi possível estimar a incidência de casos de homozigotos para o alelo mutado em um a cada 40 anos. No entanto, utilizando-se a maior frequência possível de acordo com o intervalo de confiança, esta incidência poderia atingir um a cada 13 anos. Além disso, foram estudados os pais dos dois casos relatados como semelhantes aos pacientes homozigotos para mutações na STAT5B e estes pais eram portadores da mutação c.424_427del da STAT5B em heterozigose. Para avaliar o efeito fundador, foram analisados dois...

Homozygous inactivating mutations in signal transducer and activator of transcription 5B gene (STAT5B) cause growth hormone insensitivity associated with signs of severe immune dysfunction, such as recurrent infections, lymphoid interstitial pneumonia and other autoimmune events. The phenotypic characterization of these mutations in heterozygous state has not been accomplished previously. Two patients with a homozygous STAT5B mutation (c.424_427del / p.L142RfsX19) are Brazilian brothers born in the city of Criciúma, Santa Catarina, and there is not known consanguinity in their family. Moreover, there was a report about two similar cases in this city, already deceased, suggesting that STAT5B mutations could be relatively frequent in this region. The objectives of this study were to evaluate the frequency of STAT5B c.424_427del mutation in Criciúma, to assess the existence of the founder effect and to characterize the effect of heterozygous STAT5B c.424_427del mutation on anthropometric and hormonal phenotypes. To evaluate the frequency of this mutation in Criciúma, 1192 individuals from the population were genotyped. Seven heterozygous individuals were identified, which characterized a minimum allele frequency of 0.29% (95% confidence interval: 0.08 to 0.5%), significantly higher than the frequency of other pathogenic variants described in public databases. By using the Hardy-Weinberg law, it was possible to estimate the incidence of cases of individuals homozygous for this mutation at one every 40 years. However, by using the highest possible frequency according to the confidence interval, this incidence could reach one every 13 years. Additionally, the parents of the two reported cases who were similar to patients with homozygous STAT5B mutations were genotyped and these parents were heterozygous for STAT5B c.424_427del mutation. To assess the founder effect, two markers near the mutation were analyzed in the two boys homozygous...

Mutações em heterozigose no gene do receptor tipo B dos peptídeos natriuréticos (NPR2) são causa de baixa estatura inicialmente classificada como idiopática / Heterozygous mutations in natriuretic peptide receptor-B gene (NPR2) are cause of short stature initially classified as idiopathic

Nos últimos anos, o sistema do peptídeo natriurético do tipo C (CNP) e seu receptor (NPR-B) foi apontado como um importante regulador do processo de ossificação endocondral. Vários estudos em animais evidenciam o seu papel de estímulo à proliferação e diferenciação de condrócitos e secreção de matriz extracelular. Mutações bialélicas com perda de função do gene do NPR-B (NPR2) levam a uma doença denominada displasia acromesomélica do tipo Maroteaux (AMDM), uma displasia esquelética caracterizada por baixa estatura extrema. Observa-se que familiares de pacientes com AMDM carreadores de mutação no NPR2 têm estatura abaixo da média da população a qual pertencem, sugerindo um papel de mutações em heterozigose do NPR2 como causadoras de baixa estatura idiopática (BEI). Os objetivos deste estudo foram avaliar a presença de mutações no gene NPR2 em um grupo de pacientes com BEI e correlacionar os achados moleculares com o fenótipo dos pacientes e familiares. A região codificadora do gene NPR2 foi sequenciada pelo método de Sanger em 60 pacientes com diagnóstico de BEI. Foram identificadas cinco diferentes variantes alélicas missense em heterozigose no NPR2, cada uma em um único paciente. Essas variantes foram submetidas à análise funcional in vitro para avaliação da atividade da guanililciclase e microscopia confocal para localização intracelular dos receptores NPR-B. As variantes c.226T > C / p.Ser76Pro, c.788G > C / p.Arg263Pro e c.2455C > T / p.Arg819Cys segregam com o fenótipo de baixa estatura dentro das famílias e determinam um prejuízo funcional ao NPR-B. As três variantes geram proteínas que exercem efeito dominante negativo e os receptores NPR-B com as mutações p.Ser76Pro e p.Arg263Pro não se localizam na membrana celular. As variantes c.491C > G / p.Ala164Gly e c.1636A > T / p.Asn546Tyr não segregam com o fenótipo de baixa estatura nas famílias e não se evidenciou um efeito dominante negativo. O escore-Z da altura dos indivíduos carreadores das variantes...

Over the past several years, C-type natriuretic peptide (CNP) and its receptor (NPR-B) system has emerged as an important regulator of endochondral bone growth. Animal models showed a CNP/NPR-B role in promoting chondrocyte proliferation and differentiation and matrix synthesis. Biallelic loss-of-function mutations in NPR-B gene (NPR2) cause acromesomelic dysplasia type Maroteux (AMDM), a skeletal dysplasia with extreme short stature. Relatives of patients with AMDM, heterozygous for NPR2 mutations, were noted to be shorter than expected for their population of origin, suggesting that heterozygous mutations in NPR2 could be a cause of idiopathic short stature (ISS). The objective of this study was to investigate the presence of NPR2 mutations in a group of patients with ISS and to correlate molecular findings with phenotype. The NPR2 coding region was sequenced by Sanger's method in 60 patients with ISS. Five different heterozygous missense variants in NPR2 were identified in five patients. The functional consequences of those variants were established using in vitro cell-based assay to determine guanylate cyclase activity and confocal microscopy to determine intracellular localization of NPR-B. The variants c.226T > C / p.Ser76Pro, c.788G > C / p.Arg263Pro and c.2455C > T / p.Arg819Cys segregated with short stature phenotype and were functionally deleterious. NPR-B receptors with these three variants have a dominantnegative effect and p.Ser76Pro and p.Arg263Pro NPR-B were not localized in the cell membrane. Cosegregation analysis of the variants c.491C > G / p.Ala164Gly and c.1636A > T / p.Asn546Tyr was inconclusive and they did not have a dominant negative effect. Carriers of functionally deleterious variants have a height SD score that ranged from -4.5 to -1.7. One of these patients and two relatives have disproportionate short stature and one has shortened metacarpal. In conclusion, heterozygous mutations in NPR2 gene are cause of short stature in...

La biología molecular en el estudio de la inmunopatología / Molecular Biology in the study of Immunopathology

Las técnicas de biología molecular han tenido un profundo impacto en el campo de la inmunología. Han permitido dilucidar varias interrogantes sobre el funcionamiento del sistema inmune y han aumentado nuestra habilidad para entender, diagnosticar y tratar una gran variedad de enfermedades inmunológicas. Se realizó una revisión de la literatura sobre aspectos generales de la importancia de las técnicas de biología molecular en el estudio de la respuesta inmune, que incluye conceptos generales y clasificación de las metodologías más empleadas, así como la referencia de algunas aplicaciones en el estudio de la inmunología y la inmunopatología. Se muestra información actualizada con enfoque analítico que permite ilustrar las características de los principales métodos empleados en biología molecular y su aplicación en el estudio de la respuesta inmune. La utilidad de las técnicas de biología molecular en el estudio de la respuesta inmune, ha constituido un poderoso instrumento para sus aplicaciones en el desarrollo de mejores alternativas diagnósticas y terapéuticas...

Molecular biology technical methods have caused a high impact in the field of immunology. They have made it possible to know the answer to many questions regarding the immune system function and have increased our ability to understand, diagnose and treat a great deal of immunological diseases. A review of the literature about the importance of molecular biology in the study of immune response was made, including general concepts, classification of the most used technologies, as well as some applications in the study of immunology and immunopathology. Update information with analytic view about the main methods used in molecular biology and its application in the evaluation of immune response is shown. Usefulness of molecular biology techniques are a powerfull instrument to develop new and better alternatives for diagnoses and treatment...